AMB - Análisis Medioambiental y Bioanálisis

Investigación: Análisis medioambiental

Análisis de especies metálicas tóxicas y esenciales

Análisis masivo de especies metálicas desconocidas: Metalómica Medioambiental

Análisis masivos de metabolitos: Metabolómica Medioambiental

En la evaluación de la calidad ambiental de los ecosistemas es necesario utilizar diversos tipos de métodos, generalmente químicos, biológicos y ecológicos, que aplicados de forma aislada suelen tener limitaciones. Así, no es suficiente evaluar la presencia de los contaminantes presentes en el medio ambiente sino que también hay que demostrar su presencia en los seres vivos que habitan en la zona, y, lo que es aún más importante, sus efectos biológicos. El análisis químico de contaminantes precisa herramientas analíticas cada día más sofisticadas, por el número creciente de estas sustancias, los cambios y transformaciones que sufren en el medio ambiente, la necesidad de distinguir entre diferentes especies o formas químicas, y el interés por caracterizar los metabolitos presentes en los seres vivos. A los contaminantes clásicos, (e.g. hidrocarburos, metales, plaguicidas) se han sumado otros muchos, relacionados con ciertas especies metálicas [As(III), As(V), mono- y dimetil arsénico (MMA, DMA), metilmercurio (MHg), mono-, di- y tributilestaño (MBT, DBT, TBT)] y los compuestos orgánicos persistentes (POPs, aldrín, clordano, DDT, dieldrín, endrín, bifenilos policlorados). Recientemente, preocupa la irrupción de nuevos contaminantes emergentes no recogidos en las normativas vigentes. Entre estos se encuentran los analgésicos, antiinflamatorios, antibióticos y anticonceptivos, alquilfenoles (AP) y alquilsulfonatos lineales (LAS), especies metálicas de estructura no conocida, y otros, que a pesar de hallarse en concentraciones muy bajas, son ecológicamente muy activos, actuando incluso como disruptores endocrinos.
El grupo AMB está desarrollando diversos proyectos relacionados con la calidad ambiental de áreas medioambientales emblemáticas, como el Parque Nacional de Doñana declarado por la UNESCO Reserva de la Biosfera en 1981, y que constituye un ecosistema con alto grado de biodiversidad, único en Europa. Sus marismas constituyen áreas de paso, cría e invernada para miles de aves europeas y africanas. En Doñana viven especies únicas, y en serio peligro de extinción, como el águila imperial ibérica y el lince ibérico. A pesar de su relevancia medioambiental, Doñana está amenazada por diversos factores concurrentes como la actividad agrícola de su entorno, la influencia de las zonas industriales y los riesgos de la actividad minera.

Análisis de especies metálicas y contaminantes orgánicos

Se están estudiando muestras de suelos, sedimentos y muestras biológicas en diversas estaciones de muestreo de Doñana y su entorno, así como en el Estero Domingo Rubio, alejado 50 km de Doñana pero afectado por contaminación agrícola e industrial. Se está prestando especial atención a la presencia de especies de estaño, mercurio, arsénico y selenio. Se considera la presencia de contaminantes orgánicos convencionales como plaguicidas y PCBs mediante GC-ECD y GC-MS, y PAHs usando HPLC-FLD y HPLC-MS. Asimismo, se están estudiando detergentes de amplio uso, como los sulfonatos de alquil-benceno lineales mediantre HPLC-FLD, HPLC-DAD y HPLC-MS. De manera especial se estudian técnicas de extracción innovadoras como el uso de fibras de hueca o la extracción asistida por microondas focalizados.

Una de las líneas de más interés para el grupo es la puesta a punto de procedimientos de multiespeciación en estás muestras medioambientales y el empleo de técnicas de dilución isotópica.

Se están estudiando y aplicando procedimientos para contaminantes emergentes, como fármacos (penicilinas, tetraciclinas, sulfamidas, quinolonas, fluoquinolonas, antiinflamatorios y analgésicos), alquilfenoles y bisfenil A con HPLC-FLD, HPLC-DAD y HPLC-MS. Se están probando procedimientos rápidos de extracción para estos compuestos y se están analizado sus productos de transformación mediante técnicas de masas en tanden: HPLC-IT-MS, HPLC-QqQ, y HPLC-QqTOF-MS, con fuentes de ionización electrospray (ESI), fotospray (APPI) e ionización química a presión atmosférica (APCI), según la polaridad de los analitos.

Análisis masivo de especies metálicas desconocidas: Metalómica Medioambiental

La mayoría de las rutas metabólicas precisan de enzimas con metales de transición como grupo activo de las mismas (cofactores). La biología de sistemas relaciona el metabolismo con la presencia de metales de transición, el metaloma abarca la totalidad del contenido metálico celular, considerando sus especies químicas y la localización en cada célula y organismo. Una visión sistemática del metabolismo metálico requiere la compresión de cómo los organismos detectan, adaptan y usan esos metales, así como su tráfico e interacciones en las células y los tejidos. Considerando el transporte por los fluidos biológicos y el paso a través de las barreras biológicas. La metalómica es una de las ómicas más reciente, y utiliza metales y metaloides como marcadores o etiquetas de estas moléculas en las complejas matrices biológicas.

En los procedimientos metalómicos es crítica la sensibilidad del detector atómico, utilizándose generalmente el ICP-MS, generalmente acoplado con un módulo cromatográfico, en acoplamientos simples o multidimensionales. Se suelen utilizar varios modos cromatográficos, en escala preparativa, capilar o nano-escala, pudiendo combinarse dos o tres sistemas ortogonales off-line para aumentar la resolución de las metal-biomoléculas. Los modos cromatográficos más utilizados son la exclusión de tamaño (SEC), fase reversa (RP), cromatografía de intercambio iónico (IEC), cromatografía líquida de interacción hidrofílica (HILIC) y cromatografía de afinidad (AF).

Por otro lado, es necesario combinar el enfoque basado en la espectrometría de masas inorgánicas (ICP-MS) con la espectrometría de masas orgánicas con objeto de identificar las especies desconocidas. Así el uso de ESI-MS en acoplamientos con HPLC o CE, o mediante infusión directa de la muestra es fundamental para cubrir este aspecto de la aproximación metalómica.

En diversos estudios realizados por el grupo AMB se ha estudiado la fracción citosólica de diversos órganos de ratón, en especial el hígado y el cerebro, de varias áreas de Doñana y su entorno, como El Matochal-MAT (zona de cultivo de arroz), arroyo de El Partido- PAR-1 y PAR-2 (con contaminación agrícola), arroyo de La Rocina- ROC-1 y ROC-2, y el Lucio del Palacio-LDP que se usa como control. El análisis de especies metálicas desconocidas se lleva a cabo por cromatografía de exclusión de tamaño (SEC) acoplada en serie a un detector UV y otro atómico (ICP-MS). Las columnas de SEC cubrirán un rango amplio de masa molecular para lo que se ha utilizado tres columnas: (i) 10-600 kDa, (ii) 3-70 kDa, y (iii) < 10 kDa. Se utilizan columnas analíticas y preparativas, estas últimas para aislar cantidades suficientes de biomoléculas unidas a metales, las cuales se aíslan, liofilizan y conservarán para su análisis en la segunda dimensión cromatográfica mediante HPLC con columnas de fase reversa (RP), pares iónicos (RP-IP), intercambio aniónico (SAX) o catiónico (SCX) según las especies de interés. Las metalobiomoléculas presentes en los picos más interesantes, se identificarán por espectrometría de masas en tandem. En el caso de metaloproteínas se realizará digestión con tripsina para identificación de los péptidos mediante nESI-QqTOF-MS y búsqueda en bases de datos.

Análisis masivos de metabolitos: Metabolómica Medioambiental

La metabolómica medioambiental es un campo de investigación emergente basado en la aplicación de técnicas metabolómicas para caracterizar las interacciones de los organismos vivos con su medio ambiente. Esta información es de gran valor en diversos campos, como en el estudio del riesgo de los compuestos químicos en el medio ambiente, el estudio de los modos de acción (MOA) de las sustancias tóxicas y el descubrimiento de indicadores de salud de los animales y el hombre. El uso de la metabolómica para estudiar la toxicidad de los metales va cobrando importancia en los últimos años.

En los estudios metabolómicos se consideran moléculas con masa molecular inferior a 1000 Da, que son generalmente metabolitos intermedios y productos finales de las funciones celulares, y sus niveles pueden considerarse la respuesta de los sistemas biológicos a la acción del medio ambiente. La correcta elección del procedimiento de tratamiento de muestra para la extracción de los metabolitos de los tejidos o fluidos biológicos es de gran importancia por su repercusión en los resultados.

La metabolómica, requiere técnicas analíticas de alta sensibilidad y capacidad para la identificación de las moléculas como la espectrometría de masas (MS) o la resonancia magnética nuclear (RMN). La MS se utiliza, generalmente acoplada a una técnica de separación (HPLC, CE o GC), aunque las técnicas de introducción de muestra por infusión directa se utilizan también ampliamente, aunque precisan de equipos de masa de ala resolución.